Es wurde schon gezeigt, dass neben dem Vergrößerungsfaktor das Auflösungsvermögen eine große Rolle spielt.
Da die Qualität des Zwischenbildes für die Leistung des Mikroskops von entscheidender Bedeutung ist und das Zwischenbild einzig durch das Objektiv gebildet wird, bestimmt es das Auflösungsvermögen, das mit keinem noch so stark vergrößernden Okular mehr überschritten werden kann.
Der Abstand d, den zwei Punkte im Präparat haben können, damit sie im Zwischenbild noch als zwei scharf getrennte Punkte abgebildet werden (= Grenze des Auflösungsvermögens) beträgt:
l steht für die Wellenlänge, für das sichtbare Licht liegt sie etwa zwischen 400 und 750 nm
A bezeichnet die numerische Apertur des Objektivs, die von seinem Öffnungswinkel (sin u) und dem Brechungsindex (n) des Mediums zwischen Deckglas und Frontlinse abhängt.
A = n x sin u
Aus technischen Gründen kann u nicht den Wert 90° erreichen.
| n Luft | = | 1 | Trockensysteme | ® | A höchstens 0,95 | ||
| n Zedernöl | = | 1,5 | Immersionssysteme | ® | A höchstens 1,4 |
Die Maximalwerte setzten eine optimal abgestimmte Beleuchtungseinrichtung voraus.
l = 550 nm
A = 1
d = 275 nm = 0,275 mm als etwa theoretische obere Grenze, in der Praxis liegen die Werte um 0,5 mm
Mit Schulmikroskopen wird der Wert selten erreicht. Theoretische Werte zweier Schulmikroskope für l = 550 nm:
| Zeiss | 10/0,22 | ® d = 1,25 mm | |
| 40/0,65 | ® d = 0,42 mm | ||
| Phywe | 10/0,25 | ® d = 1,10 mm | |
| 40/0,65 | ® d = 0,42 mm | ||
| 100/1,25 | ® d = 0,22 mm | Ölimmersion |
Warum gibt es eine prinzipielle Obergrenze? - Die Auflösung ist bei Abbildungen immer beschränkt:
| Negativfilm | Korngröße | |
| Drucker | dpi | |
| Fernsehgerät | Größe der Bildpunkte | |
| Kartoffeldruck | Querschnitt der "Stempel" | |
| Lichtmikroskop | Wellenlänge des sichtbaren Lichts | |
| ... | ... |
Bei den beiden vorhergehenden Abbildungen hängt die Genauigkeit, die Wiedergabe von Feinheiten von der Korngröße ab.
Bei dieser besonderen Möglichkeit der dreidimensionalen Wiedergabe kann man nur Einzelheiten auflösen, die größer sind als der Abstand zwischen zwei Nagelstiften. Haare auf der Hand, den Fingern sind nicht abbildbar.
Die Verbesserungen an den Lichtmikroskopen (Immersionsöl, UV-Licht) ergaben nur kleine Erhöhungen des Auflösungsvermögens; sie waren unverhältnismäßig teuer und umständlich zu handhaben.
Den ersehnten "Sprung" ( 200 nm ® 0,2 nm) brachte erst ein Systemwechsel. Die Folge war ähnlich der bei der Benutzung von Lupe und Lichtmikroskop - man lernte eine neue Welt kennen. Das Plasma z.B., die Grundsubstanz der lebenden Zelle, erschien nicht mehr als Flüssigkeit, es zeigte sich eine Fülle von Feinstrukturen.
Das Funktionsprinzip des EM wird nur angedeutet, wichtig ist es, die Folgen und Beschränkungen für die (biologische) Praxis zu kennen.
| Es wird ein Elektronenstrahl (» Lichtstrahlen) hergestellt, mit Feldern (» Linsen) gebündelt und auf das Präparat gelenkt. Elektronen werden von dem Objekt absorbiert, andere passieren es (Transmissionselektronenmikroskop TEM).; sie gelangen auf einen Flureszenzschirm (» Netzhaut) und das Bild kann betrachtet bzw. fotografiert werden. - Aufwendige Präparationstechnik - schon das Anfassen der Schnitte ist ein Problem (Ein Vergleich mit einem (Röhren-) Fernsehgerät bietet sich an.) ® Vakuum ® nur völlig trockene Präparate können untersucht werden ® wasserfrei = tote Zellen ® statisches Bild, Schnappschuss |
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Präparate - wasserfrei und in Kunststoff eingeschlossen
Wenn der Elektronenstrahl schon durch Luftmoleküle behindert / ausgelöscht wird, ist klar, dass nur Ultradünnschnitte untersucht werden können.
- Aufwendige Präparationstechnik - Mikrotome, Fachwissen, ...
Die mit dem Ultramikrotom angefertigten Schnitte werden mit Kupfersieben aufgenommen
Der dünne Schnitt lässt nun aber (fast) alle Elektronen durch.
- Aufwendige Präparationstechnik - "Färben" (Kontrastieren)
artefakt º künstlich gemacht, zur Täuschung angefertigt
Entwässerung und Schneiden können leicht zu einer so starken Deformation führen, dass das Ergebnis unbrauchbar ist. Das wäre nicht weiter schlimm, wenn es dafür Kriterien gäbe. Wenn man aber etwas untersucht, das man mit dem Lichtmikroskop gar nicht, sondern erst mit dem EM sehen kann, fehlen direkte Kontrollmöglichkeiten.
Da man natürlich keine gezielten Längs- oder Querschnitte der Feinstrukturen anfertigen kann, ergeben sich zusätzlich noch Interpretationsprobleme.
Die Abbildung zeigt drei parallele Schnitte durch einen Haushaltsartikel.
Im Laufe der Jahre ist es den Wissenschaftlern immer besser gelungen, Artefaktbildung zu vermeiden.
(Albert Frey-Wyssling: Lehre und Forschung - Autobiographische Erinnerungen, Stuttgart 1984)
Im Gegensatz zu dem TEM ist der Präparationsaufwand beim Rasterelektronenmikroskop (REM) geringer. Bei unserem Besuch konnten wird alle Schritte von der Probennahme über die Vergoldung bis zur fertigen Aufnahme sehen.
Abschnitt aus Bernhard Wandtners Praktikumsbericht (Frankfurt 2003)
Was ich besonders interessant fand, waren Untersuchungen am Rasterelektronenmikroskop (REM). Es ging darum, Pilzsporen zu untersuchen um festzustellen, zu welcher Art sie gehören. Dazu wird die Probe auf eine Kohlenstoffschicht geklebt und dann mit Gold überzogen. Anschließend wird sie im Mikroskop mit Elektronen beschossen und die abprallenden Elektronen erzeugen ein Bild der Oberfläche auf dem Monitor. Ein Rasterelektronenmikroskop erzeugt ein vergrößertes Abbild der Oberfläche eines Gegenstandes. Bei diesem Verfahren muss die Probe nicht dünn geschnitten sein, sie braucht nur wenig oder gar keine Aufbereitung. Anders als ein Durchstrahlungselektronenmikroskop, das einen verhältnismäßig großen Teil der Probe auf einmal erfasst, tastet ein Rasterelektronenmikroskop die Oberfläche der Probe schrittweise ab. Ein stark gebündelter Elektronenstrahl bewegt sich ähnlich dem Elektronenstrahl, der beim Fernsehen das Bild auf den Schirm "schreibt", über die gesamte Probe. Die Elektronen des gebündelten Strahles können direkt von der Oberfläche der Probe gestreut werden oder die Abstrahlung von Sekundärelektronen aus der Probenoberfläche bewirken. Diese gestreuten Elektronen werden in einem Kollektor gesammelt und von einem neben der Probe eingebauten elektronischen Zähler erfasst. Jeder abgetastete Punkt der Probe entspricht einem Pixel auf einem Fernsehbildschirm. Je mehr Elektronen der Zähler feststellt, desto heller wird das Pixel am Bildschirm. Während sich der Elektronenstrahl über die Probe bewegt, entsteht auf dem Bildschirm ein vollständiges Abbild der Probe. Rasterelektronenmikroskope erreichen eine 100 000fache und höhere Vergrößerung. Sie sind im Gegensatz zu Durchstrahlungselektronenmikroskopen und starken Lichtmikroskopen besonders dazu geeignet, die Oberfläche eines Gegenstandes realistisch und dreidimensional abzubilden.
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Oktober 2003
© B.Bossert